專訪蔡孟浩丨華東理工團隊歷時八年三次迭代改造畢赤酵母，開發(fā)即插即用通用型平臺，有望產(chǎn)業(yè)化應用
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酵母作為人們熟知的真核微生物，在食****方面的應用已有悠久的歷史，在現(xiàn)代蛋白生產(chǎn)和生物合成方面也有非常廣泛的應用。甲基營養(yǎng)型酵母 —— 巴斯德畢赤酵母，因其生長密度高、蛋白表達強、遺傳穩(wěn)定好和糖基化修飾溫和等優(yōu)點，在學術研究和工業(yè)生產(chǎn)中均展現(xiàn)了很好的應用效果，已成為重組蛋白表達的優(yōu)選底盤細胞。
然而，畢赤酵母作為一種非模式生物體，其強啟動子種類和數(shù)量有限，且多基于甲醇誘導特性，在工業(yè)設施安全和食品應用安全方面存在一定的風險。同時，這些啟動子的轉錄調控模式單一，多受發(fā)酵碳源的嚴格阻遏，使大宗蛋白或化學品生產(chǎn)中的底物譜受限，很大程度上限制了其在更廣闊場景下的應用潛力。
近日，華東理工大學生物工程學院蔡孟浩課題組在新型酵母表達設計方面取得重要進展，開發(fā)了可響應用戶自定義信號的高效畢赤酵母蛋白表達平臺，相關成果已在線發(fā)表于 Science Advances 上。
可響應用戶自定義信號：
只需找到已報道的、或用戶自定義篩選條件通過組學篩選的低強度啟動子，即可接入 SynPic-X 平臺（高效表達的畢赤酵母平臺）實現(xiàn)響應用戶自定義條件的高效表達。理論上，通過目前的測序和組學技術，較易篩選獲得低強度啟動子。
借此機會，生輝 SynBio 邀請到了蔡孟浩來與我們分享他的研究進展。
圖丨蔡孟浩（來源：受訪者提供）蔡孟浩本科畢業(yè)于華東理工大學理工優(yōu)秀生部，隨后保研到華東理工大學生物工程學院張元興教授和周祥山教授課題組進行碩博連讀，期間還前往英國布里斯托大學化學院 Russell J. Cox 教授課題組進行聯(lián)合培養(yǎng)，開展真菌聚酮****物的組合生物合成及發(fā)酵工程研究?，F(xiàn)為華東理工大學生物工程學院副教授、博士生導師、生物反應器工程國家重點實驗室 PI，獲得國家高層次特殊支持計劃青年拔尖人才、上海市青年科技啟明星計劃資助。
“盡管組合生物合成是合成生物學的方向之一，但其化學學科屬性更強，因此上學期間我對合成生物學并不了解。直到 2014 年參加了冷泉港亞洲合成生物學國際會議，在聆聽麻省理工學院 Christopher Voigt 教授的 “Programming cells as a placeholder” 主題演講后，如醍醐灌頂，決定融合以往的科研經(jīng)歷，開設合成生物學研究方向?！?/span>
目前，其主要研究方向聚焦畢赤酵母新型細胞工廠創(chuàng)制與應用，包括特色酵母元器件設計、新型酵母底盤開發(fā)、重組蛋白表達及天然產(chǎn)物合成應用。
即插即用的新型酵母表達平臺“畢赤酵母作為底盤細胞，在工業(yè)中廣泛用于蛋白表達，但表達過程中需要一個強誘導型啟動子。這個菌常用的 PAOX1（醇氧化酶基因）啟動子雖強度較強，但嚴謹性也高，有且只有甲醇存在的條件下，才能誘導開啟，若混雜其他碳源，就會產(chǎn)生阻遏而無法表達，因此使用場景相對較窄，產(chǎn)品體量較小?！?蔡孟浩說道。
隨著工業(yè)生物技術體系快速發(fā)展，未來生物制造的體系需做到很大規(guī)模。但畢赤酵母僅能利用甲醇進行高效誘導表達的特性存在三方面的問題。其一，甲醇具有毒性，大規(guī)模生物制造時考慮成本問題產(chǎn)品往往無法做到很精細的純化，比如若用于制造食品，則會給人體帶來傷害；其二，甲醇易燃易爆，大規(guī)模生物制造使用時的安全性仍需評估；其三，大規(guī)模應用需考慮成本問題，低成本意味著工業(yè)發(fā)酵時復合原料底物可能會混有多種阻遏碳源，這會阻遏畢赤酵母對甲醇的代謝利用，并且與其只能在甲醇存在的條件下誘導表達相矛盾。
“基于這三方面問題，我們希望畢赤酵母作為底盤細胞既能保持它的強表達優(yōu)勢，同時也具有較強魯棒性?！币虼耍堂虾普n題組歷時八年對畢赤酵母進行三代改造，使其能突破單一甲醇誘導的高效表達蛋白。
他介紹道，第一代體系主要解決的是畢赤酵母甲醇調控過于嚴謹問題，通過解析誘導甲醇的轉錄調控機制，找到一個關鍵的轉錄激活因子，發(fā)現(xiàn)該轉錄因子與其他幾個轉錄因子在響應甲醇信號過程中存在級聯(lián)傳遞機制?；诖藱C制，對畢赤酵母進行了代謝工程層面的改造。簡單改造后能夠讓畢赤酵母實現(xiàn)部分甲醇誘導的碳源脫阻遏，可以用葡萄糖和甘油產(chǎn)生類似誘導的效應，但表達能力沒有甲醇強。
為解決此問題，蔡孟浩課題組利用合成生物學技術設計了簡單遺傳線路，最核心的是通過人工設計的方式讓激活因子更好地結合啟動子，激發(fā)其表達，改造之后的第二代體系表達強度得到提升。但由于轉錄放大效應，滲漏表達也提高了。在工業(yè)生產(chǎn)中，畢赤酵母生長階段盡量不期望出現(xiàn)產(chǎn)物的合成，否則會給細胞代謝帶來較重負擔，最終影響生物量和產(chǎn)物量。
因此第三代要解決的是進一步去除滲漏表達問題，同時保持畢赤酵母很高的表達強度。蔡孟浩課題組通過分析畢赤酵母天然轉錄調控網(wǎng)絡并重塑轉錄調控機器，設計了一套具有高強度表達能力的轉錄信號增益器件 iTSAD，實現(xiàn)輸入信號的高效放大，達到商業(yè)化畢赤酵母 PAOX1 表達強度的 5.2 倍。
同時，針對其介導的滲漏表達水平較高的問題，基于 CRISPR 基因調控技術，設計 CRISPRi 阻遏器件以解決高滲漏表達問題，并設計 CRISPRa 激活器件以抵消 CRISPRi 的高限表達壓制，以此可響應靈活、低強度輸入信號而協(xié)同控制 iTSAD 器件，有效解決高滲漏表達問題，并通過對引導 RNA 組合的理性設計和篩選驗證，實現(xiàn)完整系統(tǒng)的高強度表達輸出。
圖 A丨響應自定義信號的合成型畢赤酵母平臺（SynPic-X）的開發(fā)由此，最終開發(fā)成功具有高強度、低滲漏、可編程特性的合成型畢赤酵母表達平臺 SynPic-X?！斑@是一個通用型的高強度、可編程平臺，通過簡單地 “插拔” 已知的或簡單組學篩選的單一低輸入啟動子即可實現(xiàn)響應用戶自定義信號的高水平蛋白表達和嚴謹調控。”
有望產(chǎn)業(yè)化應用目前，針對該表達平臺，蔡孟浩團隊輸入了不同類型的啟動子進行檢驗，分別構建了鼠李糖信號響應系統(tǒng) SynPic-R、甲醇信號響應系統(tǒng) SynPic-M 和硫胺素信號響應系統(tǒng) SynPic-T，均可實現(xiàn)對特定信號的嚴謹調控和高效響應，在激活狀態(tài)下分別達到商業(yè)化畢赤酵母 PAOX1 表達強度的 3.8 倍、4.4 倍和 3.3 倍。
為了測試 SynPic-X 平臺的實際應用價值和潛力，蔡孟浩團隊還選取鼠李糖信號響應系統(tǒng) SynPic-R 用于驅動工業(yè)淀粉酶的表達，在 3 升反應器水平得到了與商業(yè)化畢赤酵母 PAOX1 甲醇誘導表達相當?shù)漠a(chǎn)量，且生產(chǎn)工藝控制更為綠色、安全、簡便，展現(xiàn)了良好的工業(yè)應用前景。
（來源：受訪者）“下一步我們將繼續(xù)升級畢赤酵母細胞工廠，主要包括兩個方面，其一是設計開發(fā)多底物協(xié)同利用型底盤，以滿足大規(guī)模蛋白及天然產(chǎn)物制造的低成本、高魯棒性需求；其二是設計開發(fā)翻譯后修飾定制型底盤，以滿足動植物源****用活性分子的高活性和高效生物合成需求。”
除了畢赤酵母發(fā)酵平臺，蔡孟浩團隊還建有絲狀真菌和大腸桿菌發(fā)酵平臺體系，其中，畢赤酵母發(fā)酵平臺主要針對重組蛋白及小分子****物、新型食品替代蛋白；絲狀真菌發(fā)酵平臺主要針對天然****物及色素；大腸桿菌發(fā)酵平臺主要針對特殊功能酶等。
蔡孟浩說道，“我們前期開發(fā)的畢赤酵母表達系統(tǒng)及蛋白****物表達應用已經(jīng)實現(xiàn)企業(yè)轉讓，同時在新型替代蛋白、抗衰****物開發(fā)方面也在與企業(yè)開展密切的研發(fā)合作，有望在 1~2 年內實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化應用。”
采訪最后，蔡孟浩老師也向我們分享了他的科研經(jīng)驗和培養(yǎng)學生的心得體會，他認為研究要 “博觀約取”，廣泛汲取新學術思想和技術方法，但也要以應用出口為導向進行謹慎選取和融合，基于此的 “機制 - 重構 - 應用” 研究思路和目標會更加明確，適合應用基礎研究體系。
在培養(yǎng)學生方面，要引導（建立思路）、鼓勵（提升信心）、敦促（增強動力）相結合，這對于學生的獨立和快速成長非常重要。
參考資料：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abl5166
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