摘要：為了快速、定量檢測肉類食品中瘦肉精含量，采用了一種先進的激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)進行檢測。首先將稀釋好的樣品滴加在用免疫層析技術(shù)制作的試紙卡上，然后使用638 nm波長的半導(dǎo)體激光器照射試紙卡，激發(fā)出的熒光通過光敏二極管接收，通過采集熒光強度來實現(xiàn)瘦肉精含量的檢測。通過實驗驗證，該檢測系統(tǒng)能夠快速、定量、精確的檢測瘦肉精的含量，檢測時間為6 s，測量量程為0.0～0.3 ppb，檢測靈敏度為0.01 ppb。

關(guān)鍵詞：瘦肉精;激光誘導(dǎo)熒光技術(shù);免疫層析技術(shù);半導(dǎo)體激光器;光敏二極管

引言

本設(shè)計在傳統(tǒng)的免疫法基礎(chǔ)上進行改良，采用了激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)和熒光免疫分析法，實現(xiàn)了對瘦肉精的快速、定量、精確檢測，具有高分辨率、快速響應(yīng)、高靈敏度、抗干擾能力強等優(yōu)點。

1 檢測系統(tǒng)的工作原理與組成

1.1 光學(xué)檢測原理

本設(shè)計選用的半導(dǎo)體激光器的光功率最大是5 mW，最大工作電流是40 mA，正常工作電流35 mA，正常工作電壓是2.2 V，最大反向工作電壓是2 V，波長范圍是630～640 nm，中心波長為638 nm。激發(fā)出來的熒光波長為680 nm，所選用的光敏二極管S5106能夠感應(yīng)的波長范圍是320～1 100 nm，接收靈敏度最高的是960 nm的光，接收熒光的靈敏度約為0.45。

半導(dǎo)體激光器打出的638 nm波長的激光通過二向色鏡反射，反射的激光再通過透鏡1聚焦到檢測試紙卡上，這樣激光能量能夠最大化地聚集到試紙卡上，此時能最大激發(fā)出熒光;激發(fā)出來的680 nm的熒光通過二向色鏡透射，熒光照射到濾光片上，濾光片透過的光波長為660～700 nm，這樣不在這個波長范圍的雜散光就能被濾除掉;熒光再通過透鏡2聚焦到光闌上面的光孔，光闌也能擋住一部分雜散光，聚焦的熒光能夠最大化地聚集到光敏二極管的接收面上，這樣設(shè)計的光路不僅能夠很好地濾除雜散光，而且還能最大化地聚集激光能量和最大化地激發(fā)熒光，激發(fā)的熒光也能夠最大化地聚集到光敏二極管上，這樣能最有效地抑制噪聲、最有效地激發(fā)熒光和接收熒光，有利于熒光信號的采集和測量的精度提高。

光路檢測圖如圖1所示。

1.2 試紙卡制作原理

免疫層析技術(shù)是建立在層析技術(shù)和抗原-抗體特異性免疫反應(yīng)基礎(chǔ)上的一項新興免疫檢測技術(shù)。免疫層析技術(shù)以固定有檢測線T和控制線C的條狀纖維層析材料為固定相，測試液為流動相，通過毛細(xì)作用使待測物在層析條上移動。其巾待測物在T線處發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，游離物在C線處發(fā)生免疫反應(yīng)。

常用免疫層析熒光法包括競爭法和夾心法，本設(shè)計檢測法采用競爭法，競爭法主要用于測量小分子抗原，如克倫特羅、萊克多巴胺等。競爭法試紙卡制作示意圖如圖2所示。

待測樣本中的抗原濃度越高，則熒光素標(biāo)記的抗原與單克隆抗體形成抗原抗體復(fù)合物的量就越少，T線上熒光免疫復(fù)合物的量也就越少，待測樣本中克倫特羅的濃度與T線信號成負(fù)相關(guān)。而C線上捕獲的熒光素標(biāo)記兔抗信號值則相對固定。通過激光對檢測卡進行掃描，根據(jù)克倫特羅濃度與熒光信號強度成負(fù)相關(guān)，獲得待測樣本中克倫特羅的準(zhǔn)確濃度。

1.3 系統(tǒng)硬件設(shè)計

系統(tǒng)硬件主要由控制器、電源、激光器驅(qū)動與保護、步進電機驅(qū)動、信號處理及采集、按鍵與顯示屏等組成?？刂破鞑捎没贏RM Cort ex—M4核的STM32F407VGT6，主頻頻率為168 MHz。主要硬件框圖如圖3所示。半導(dǎo)體激光器的驅(qū)動采用恒流驅(qū)動，驅(qū)動電流值由控制器設(shè)定，激光誘導(dǎo)的熒光束通過光敏二極管接收后轉(zhuǎn)換成電流值，電流值轉(zhuǎn)換成電壓后經(jīng)過放大和濾波送到A/D芯片采集，采集后轉(zhuǎn)換成濃度值在顯示屏上顯示，實現(xiàn)定量檢測。試紙卡通過步進電機驅(qū)動做直線運動，實現(xiàn)整個試紙卡的掃描采樣。下面主要介紹半導(dǎo)體激光器的驅(qū)動電路和前置信號處理電路。

1.3.1 半導(dǎo)體激光器的驅(qū)動電路

半導(dǎo)體激光器的驅(qū)動電路主要由電流源組成。激光器對電流沖擊的承受能力較差，電流微小的變化將引起光輸出的變化，這些變化有可能影響激光器的使用壽命，因此在實際應(yīng)用中對驅(qū)動電流源的性能和安全保護有很高的要求。為了能夠很好地觀察熒光信號的強弱變化，設(shè)計激光器的電流源連續(xù)可調(diào)節(jié)，改變驅(qū)動電流大小，同時改變激光器的光功率。該電路的原理圖如圖4所示，電流源供電通過LDO給其供電，減小電源噪聲，使激光器工作在穩(wěn)定可靠條件下。

U1為數(shù)字轉(zhuǎn)化為模擬信號芯片，輸出電壓在0～4.096 V可調(diào)，電流源由運算放大器U2A，精密電阻R1、R2、R4、R7和i極管Q1組成。原理如下，根據(jù)虛斷的概念可得：

由式(7)可以得知，半導(dǎo)體激光器的驅(qū)動電流與激光器的阻抗無關(guān)，只與輸入電壓VIN和精密電阻R5、R6相關(guān)，驅(qū)動電流通過調(diào)節(jié)輸入電壓大小實現(xiàn)連續(xù)可調(diào)。

1.3.2 信號處理電路

光敏二極管的PN結(jié)有一個結(jié)電容和一個寄生電阻，結(jié)電容和采樣電阻組成了一個RC充電回路，RC值的大小決定了光敏二極管的響應(yīng)速度。光敏二極管在反向偏置電壓作用下工作，再加上寄生電阻的存在，在沒有光信號輸入時，光敏二極管仍然會流出電流，該電流稱為暗電

流。S5106的暗電流正常值為0.2 nA。由于結(jié)電容的存在，該結(jié)電容延遲了信號的響應(yīng)，在輸出信號端會產(chǎn)生震蕩，在取樣電阻R2上需并聯(lián)一個合適容值的電容C4用來對電路進行補償，消除信號的震蕩。

當(dāng)激光照射在試紙卡上時，激發(fā)出來的熒光反射到S5106上形成光電流，通過電阻R2實現(xiàn)I/V轉(zhuǎn)換，將電流轉(zhuǎn)換成電壓值。由于熒光信號非常微弱，產(chǎn)生的光電流值一般都為幾個nA，再加上運算放大器輸入級偏置電流的存在，為減小偏置電流對光電流的影響，一般需要選取偏置電流極小的運算放大器，可選取pA級別的。其中I/V轉(zhuǎn)換原理圖如圖5所示。

1.4 系統(tǒng)軟件設(shè)計

1.4.1 系統(tǒng)軟件總流程

系統(tǒng)軟件設(shè)計采用C語言開發(fā)，主程序結(jié)構(gòu)如圖6所示。儀器上電后，進行系統(tǒng)初始化，讀取外部EEPROM的保存參數(shù)，接著系統(tǒng)開始自檢，液晶屏顯示“系統(tǒng)自檢中”。自檢內(nèi)容包括電源自檢、外部RTC自檢、外部EEPROM自檢、電機自檢、激光器自檢、電路自檢、溫度傳感器自檢。自檢不通過，則報警，液晶屏顯示相應(yīng)的報警碼，否則進入主菜單界面。在主菜單頁面中，在“測試”頁面中按下ENTER鍵進入測試流程，在“查詢”頁面中按下ENTER鍵進入歷史記錄流程，在“設(shè)置”頁面中按下ENTER鍵則進入設(shè)置流程。在設(shè)置頁面中，在“時間與日期”頁面中按下ENTER鍵進入設(shè)置時間與日期流程。在“清空歷史記錄”頁面中按下ENTER鍵進入清空歷史記錄流程。在“信息”頁面中按下ENTER鍵查看儀器的基本信息。

1.4.2 尋峰算法

(1)尋峰要求

①任意尋峰范圍：通過測試試紙條得知，共300個點，從START到END，如200～500。

②若為選取的峰，則峰高必須大于一個閾值THRESHOLD，如100 mV。

③尋峰完畢后，峰的個數(shù)必須為2個，否則尋峰失敗。

④峰的寬度通過測試試紙得知，是一個定值WIDTH，如60。

⑤通過計算峰高之比來求得比值。

⑥可往本底不平滑的情況進行。

(2)自動尋峰算法

自動尋峰方法有多種，如高斯乘積函數(shù)法，導(dǎo)數(shù)法(一階、二階、三階)，對稱零面積法，協(xié)方差法等。其中，高斯乘積函數(shù)尋峰法可靠性較差;導(dǎo)數(shù)法(一階、二階、三階)，比較簡單;對稱零面積法可準(zhǔn)確識別弱峰;協(xié)方差法較為復(fù)雜。而這些高級的尋峰方法主要用于光譜分析中識別弱峰、重峰、假峰等。

本設(shè)計采用常見的一階導(dǎo)數(shù)法來進行自動尋峰，該方法非常簡單且比較準(zhǔn)確，很容易在嵌入式處理器中用軟件實現(xiàn)。

自動尋峰算法流程如下：

①取得300點尋峰范圍內(nèi)的各索引值的電壓值V。

②分別求得(300—1)個相鄰數(shù)值之間的差值d。

③在(WIDTH/2，END—START—WIDTH/2)范圍內(nèi)開始尋峰。

④取得極大值后，其索引值為i。分別求得左有索引值LEFT和RIGHT。

⑤通過左右索引值及各對應(yīng)的電壓值擬合一條直線，并求出 i+1處對應(yīng)的峰高。

⑥若該峰高大于閾值THRESHOLD，且峰的個數(shù)≤2，則將該峰高存入數(shù)組中，并將索引值i加上WIDTH/2。

⑦尋峰完畢或者出現(xiàn)峰的個數(shù)大于2，則退出尋峰。

⑧尋峰結(jié)束后，如果峰的個數(shù)為2個，則通過計算峰高的比值即C/T，將該比值代入公式中即可求出待測物質(zhì)的濃度值。

導(dǎo)數(shù)法示意圖如圖7所示。

2 系統(tǒng)測試結(jié)果

試紙卡在步進電機的驅(qū)動下做直線運動，通過光學(xué)檢測系統(tǒng)對其進行逐步掃描和信號采集，采集到的信號值通過上位機軟件顯示，采樣到的信號值在T線和C線處形成兩個波峰，克倫特羅的濃度與T線信號成負(fù)相關(guān)，而C線上捕獲的熒光素標(biāo)記兔抗信號值則相對固定，C線峰值用作參照，通過尋找T線和C線處的峰值，再通過T線和C線峰值的比值來計算克倫特羅的濃度。

現(xiàn)以測試的一組克倫特羅濃度值為例，采樣到的信號值上位機顯示波形圖如圖8所示。檢測時間總共耗時6 s，其中橫坐標(biāo)為采樣的點數(shù)，總共采樣1 500個點，1 ms采樣一個點，縱坐標(biāo)為每點所對應(yīng)的采樣電壓值，兩個波峰分別為T線和C線處的波峰，T線所對應(yīng)的峰高與被測樣品濃度成負(fù)相關(guān)，C線所對應(yīng)的峰高是用作參照的，用來消除背景干擾。

根據(jù)尋峰算法可得T線峰高為0.564 V，C線峰高為0.258 V，比值為2.186，代入

。其中y為濃度值，x為比值，得出克倫特羅濃度為0.137 ppb。檢測量程為0.0～0.3 ppb，檢測靈敏度為0.01 ppb。

結(jié)語

本文介紹了一種以激光技術(shù)、熒光免疫層析技術(shù)和激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)為基礎(chǔ)的定量瘦肉精檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)實現(xiàn)了瘦肉精的快速定量檢測，檢測靈敏度達到了0.01 ppb，同時檢測時間短，能夠大批量檢測，是一個實用且完整的系統(tǒng)，對瘦肉精的精確檢測具有很大的參考意義。