在非哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)化得到的蛋白質(zhì)，常常會(huì)因錯(cuò)誤的折疊修飾、分子間相互作用、錯(cuò)誤的細(xì)胞定位等因素，無(wú)法在復(fù)雜的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中正常工作。因此，開發(fā)能夠應(yīng)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的定向進(jìn)化技術(shù)是一大趨勢(shì)。

“我們開發(fā)的 TADR 系統(tǒng)應(yīng)用范圍更廣，在大腸桿菌、酵母甚至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中都有應(yīng)用潛力?！?易嘯說。

易嘯是中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所（以下簡(jiǎn)稱為 “合成所”）研究員，博士師從明尼蘇達(dá)大學(xué)分子進(jìn)化學(xué)家 Antony Dean 教授學(xué)習(xí)種群遺傳學(xué)和生態(tài)學(xué)，并與其導(dǎo)師提出了生物多樣性的新理論，后期從理論轉(zhuǎn)向?qū)嶒?yàn)研究。他在博士后期間與工程生物學(xué)結(jié)緣。

今年 7 月，易嘯作為第一作者和并列通訊作者在 Science Advances 上發(fā)表最新研究成果。該團(tuán)隊(duì)利用合成生物學(xué)的方法開發(fā)了一個(gè) “智能” 細(xì)菌系統(tǒng) —— 靶向性人工 DNA 復(fù)制體（TADR），該系統(tǒng)能夠在活細(xì)胞內(nèi)將大量突變快速靶向到指定的任意一段 DNA 序列上，而不會(huì)影響基因組的其他部分。

“TADR 系統(tǒng)將突變率提高了 23 萬(wàn)倍，一天即可完成變異篩選，快速進(jìn)化基因。我們正在探索潛在應(yīng)用方向，比如說用該系統(tǒng)進(jìn)化指定的大分子或者抗體?！?易嘯

TADR 系統(tǒng)是易嘯在博士后期間的一個(gè)合成生物學(xué)項(xiàng)目。在博士后研究階段，易嘯花費(fèi) 5 年時(shí)間獨(dú)立設(shè)計(jì)開發(fā)出了 TADR 系統(tǒng)，并獲得了相關(guān)技術(shù)的美國(guó)專利?，F(xiàn)在他已經(jīng)在合成所材料合成生物學(xué)中心成立了合成進(jìn)化實(shí)驗(yàn)室，該實(shí)驗(yàn)室的一大重點(diǎn)就是圍繞 TADR 系統(tǒng)展開基礎(chǔ)研究和探索應(yīng)用場(chǎng)景，解決科學(xué)和生產(chǎn)問題。 

易嘯坦言，現(xiàn)階段，TADR 系統(tǒng)是其在研究生涯過程中最有成就感的一項(xiàng)研究。

將突變率提高 23 萬(wàn)倍，一天即可完成變異篩選

細(xì)胞外突變法是目前最為成熟且直觀的一種定向進(jìn)化方法，包括易錯(cuò) PCR（error-prone PCR）、易突變菌株（mutator strains of bacteria）以及可產(chǎn)生非隨機(jī)突變的定點(diǎn)突變（site-directed mutagenesis）等。

然而，這種方法往往需要密集的人工操作，多數(shù)情況下只能在有限的突變庫(kù)上進(jìn)行一輪進(jìn)化。如果想要得到更有優(yōu)勢(shì)的蛋白質(zhì)，或者完成更復(fù)雜的定向進(jìn)化目標(biāo)，就需要更大體量的突變庫(kù)，以及進(jìn)行多輪迭代進(jìn)化。

為了突破這些瓶頸，加快進(jìn)化速度，更快獲得更復(fù)雜的進(jìn)化目標(biāo)，研究人員開始嘗試開發(fā)細(xì)胞內(nèi)突變方式。

易嘯團(tuán)隊(duì)開發(fā)的 TADR 系統(tǒng)就是一種細(xì)胞內(nèi)突變方法，整個(gè)進(jìn)化過程在活細(xì)胞里面完成。TADR 系統(tǒng)系統(tǒng)也叫最簡(jiǎn) DNA 復(fù)制體，是由三個(gè)蛋白質(zhì)組成的蛋白復(fù)合體，分別為噬菌體蛋白 CisA、細(xì)菌 Rep 解旋酶、T5 噬菌體 DNA 聚合酶的出錯(cuò)性突變子。

該系統(tǒng)能夠在短時(shí)間內(nèi)把大量突變靶向指定的 DNA 上面，同時(shí)保留基因組其他部分的完整性。

具體來(lái)說，他找到了一種噬菌體，其在天然復(fù)制過程中有一個(gè)能夠特異性識(shí)別 30 堿基對(duì)序列的蛋白，識(shí)別以后，噬菌體就從該位點(diǎn)開始復(fù)制 DNA。所以他把出錯(cuò)率高的 DNA 聚合酶融合到了這個(gè)噬菌體的蛋白上，利用這個(gè)噬菌體的蛋白去把出錯(cuò)率高的 DNA 聚合體靶向到指定突變的 DNA 上游。

易錯(cuò) PCR 是一種簡(jiǎn)便快速在 DNA 序列中隨機(jī)制造突變的方法，通過改變傳統(tǒng) PCR 反應(yīng)體系中的 Mg2+ 濃度、dNTP 的濃度比例、pH 值等，使堿基在一定程度上隨機(jī)引入錯(cuò)誤而創(chuàng)造序列多樣性文庫(kù)。這種方法的關(guān)鍵在于控制合適的突變頻率，較低的突變率能夠積累大部分的有益突變，而較高的錯(cuò)摻率則會(huì)產(chǎn)生中性突變或有害突變。

“與基于出錯(cuò) PCR 和體外質(zhì)粒構(gòu)建的傳統(tǒng)定向進(jìn)化方法相比，TADR 可以避免分子連接、細(xì)胞轉(zhuǎn)化等效率極低的步驟，從而實(shí)現(xiàn)在活細(xì)胞內(nèi)快速連續(xù)進(jìn)化分子和細(xì)胞表型的潛力。” 易嘯說。

該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對(duì) TADR 系統(tǒng)進(jìn)行了量化，研究表示，與野生型突變速率相比，TADR 的突變速率提高了約 23 萬(wàn)倍，即 2.3*10^5。

易嘯表示，該系統(tǒng)可以快速找到非常低頻的有益突變，加速分子突變速率。比如說，使用傳統(tǒng)方法可能需要一個(gè)星期，利用 TADR 只需一天即可完成變異篩選。

該系統(tǒng)可能會(huì)與合成所大設(shè)施的功能結(jié)合起來(lái)，相當(dāng)于添加了一個(gè)分子突變的功能檔。易嘯透露，還需要在功能檔上加一個(gè)細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)的模塊。最終與大設(shè)施形成一個(gè)連續(xù)突變和大規(guī)模篩選的閉環(huán)，不斷繼續(xù)循環(huán)，能夠非?？焖僭趯?shí)驗(yàn)室里面進(jìn)化出我們想要的大分子。

操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用場(chǎng)景更廣

在細(xì)胞內(nèi)連續(xù)突變領(lǐng)域，目前已有兩大成熟系統(tǒng)，一是哈佛大學(xué)劉如謙團(tuán)隊(duì)于 2011 年開發(fā)的噬菌體輔助的連續(xù)進(jìn)化方法（phage-assisted continuous evolution，PACE），另一種方法是加州大學(xué)爾灣分校教授 Chang C. Liu 開發(fā)的一種正交 DNA 聚合酶 - 復(fù)制子系統(tǒng)（orthogonal DNA replication，OrthoRep）。

PACE 系統(tǒng)在許多蛋白質(zhì)進(jìn)化應(yīng)用中已經(jīng)得到了驗(yàn)證，但是只有與細(xì)菌中基因轉(zhuǎn)錄相關(guān)時(shí)，PACE 系統(tǒng)才可以進(jìn)化給定的目標(biāo)蛋白。也就是說，給定的目標(biāo)蛋白只能在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)進(jìn)化，折疊不良或者需要翻譯后修飾都會(huì)妨礙利用 PACE 系統(tǒng)的進(jìn)化。 

與 PACE 系統(tǒng)類似，OrthoRep 系統(tǒng)對(duì)生物物種也有選擇性，需要與酵母增殖活動(dòng)相關(guān)，只能在酵母（真核細(xì)胞）中才能進(jìn)行功能性表達(dá)。

“這兩大系統(tǒng)在概念上實(shí)現(xiàn)了一定的創(chuàng)新，可以相應(yīng)解決一些問題，但是存在一定的局限性，很多分子進(jìn)化問題無(wú)法利用這兩個(gè)系統(tǒng)解決，應(yīng)用場(chǎng)景受限?！?易嘯說。

正是看到了這兩大系統(tǒng)各自存在的盲區(qū)，易嘯在博士后研究期間專注于開發(fā)一種可以在哺乳動(dòng)物甚至更多生物物種中使用的系統(tǒng)。

在論文中，易嘯利用合成生物學(xué)思路構(gòu)建了 TADR 系統(tǒng)，該系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可以實(shí)現(xiàn)模塊化，比如說關(guān)閉 TADR 系統(tǒng)后，細(xì)胞和目標(biāo)質(zhì)粒仍然能夠繼續(xù)增殖。模塊化能力也提供了 TADR 擴(kuò)展到其他細(xì)胞類型甚至無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中的可能性。 

易嘯介紹，TADR 系統(tǒng)比前兩個(gè)系統(tǒng)操作更加簡(jiǎn)單，更容易上手。從原理上講，它可能在酵母、甚至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中快速進(jìn)化，應(yīng)用場(chǎng)景很廣，幾乎沒有限制。 

“我的實(shí)驗(yàn)室接下來(lái)將會(huì)開展相關(guān)研究，把該系統(tǒng)應(yīng)用到不同的物種中，進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用范圍。” 易嘯繼續(xù)補(bǔ)充。

現(xiàn)階段，易嘯將該系統(tǒng)的應(yīng)用方向瞄準(zhǔn)了材料領(lǐng)域，現(xiàn)已與合成所材料合成生物學(xué)中心研究員鐘超進(jìn)行了深入交流。

“材料研究涉及到物理、化學(xué)原理和實(shí)驗(yàn)，而這些也恰恰是做進(jìn)化、篩選的基礎(chǔ)。實(shí)現(xiàn)物理、化學(xué)、生物的交叉融合，這是一個(gè)比較新的應(yīng)用方向，我們可以在實(shí)驗(yàn)室快速進(jìn)化和篩選活體材料所需的性質(zhì)，加強(qiáng)現(xiàn)有材料性質(zhì)，甚至進(jìn)化出一些原本不存在的材料性質(zhì)?！?/span>

“合成所的學(xué)術(shù)氛圍就像年輕人共同創(chuàng)業(yè)”

今年是易嘯回到合成所成立實(shí)驗(yàn)室開展研究工作的第一個(gè)年頭，他于 2008 年本科畢業(yè)后赴美攻讀博士學(xué)位，加入合成所之前，他已經(jīng)在海外求學(xué) 12 載。

對(duì)于易嘯來(lái)說，TADR 系統(tǒng)的設(shè)計(jì)和開發(fā)工作也并非一帆風(fēng)順。

“在美國(guó)進(jìn)行博士后期間，我用了整整 5 年才開發(fā)出 TADR 系統(tǒng)。其中前 3 年半全部都在試錯(cuò)，而且失敗得一塌糊涂，TADR 系統(tǒng)最開始的設(shè)計(jì)和現(xiàn)在的設(shè)計(jì)幾乎完全不同，所以開發(fā)出的系統(tǒng)一直存在缺點(diǎn)。直到最后一年半時(shí)間，TADR 才開始達(dá)到預(yù)期，可想而知，我在前 3 年半時(shí)間面臨的一些困難和內(nèi)心的煎熬。” 易嘯回憶道。

在他看來(lái)，科研工作中總是會(huì)經(jīng)歷或大或小的挫折，我認(rèn)為在這期間最重要的是要對(duì)科研工作保持堅(jiān)持執(zhí)著的心態(tài)。

“作為一線科研人員，我們需要做一些科學(xué)探索工作，不斷探索人類未知的前沿領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)新概念，甚至顛覆一些陳舊的認(rèn)知。同時(shí)還需要有一定的社會(huì)關(guān)懷，制定與社會(huì)利益相關(guān)的遠(yuǎn)大目標(biāo)?！?易嘯說。

這一點(diǎn)也與中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院（以下簡(jiǎn)稱深圳先進(jìn)院）“頂天立地” 的理念也不謀而合。即 “天” 是學(xué)問，“地” 是產(chǎn)業(yè)，“頂天立地” 理念貫穿于深圳先進(jìn)院十個(gè)所的發(fā)展始終，作為其中較為年輕且發(fā)展迅猛的研究所，合成所亦是如此。換言之，造物致知就是頂天，造物致用就是立地。

“ 合成所的學(xué)術(shù)氛圍很活躍，老師們也都很年輕，加入合成所就好像一幫年輕人共同去創(chuàng)業(yè)，大家一起去干一番自己的事業(yè)。” 易嘯坦言。

關(guān)于未來(lái)的發(fā)展規(guī)劃，易嘯將重點(diǎn)圍繞兩個(gè)研究方向：第一個(gè)方向是偏向于基礎(chǔ)科學(xué)研究，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化細(xì)胞，將統(tǒng)一進(jìn)化過程重復(fù) N 次，探索生命體的可能空間；第二個(gè)方向是基于 TADR 的工程應(yīng)用，在三年內(nèi)使該技術(shù)更成熟，未來(lái)可以讓蛋白質(zhì)工程、大分子開發(fā)人員等更多科研人員都可以用上 TADR 系統(tǒng)。

同時(shí)，觀鳥是易嘯的愛好之一，辦公桌上的望遠(yuǎn)鏡、單反相機(jī)都是他觀鳥的必備神器。最近易嘯老師會(huì)在深圳先進(jìn)院旁邊的大沙河公園中用無(wú)人機(jī)拍水鳥，“以鷺這種類型的鳥為例，在大沙河上基本都能夠找到，比如蒼鷺、大白鷺、小白鷺，夜鷺……”