文章導(dǎo)讀：

胚在種子內(nèi)最初的自由擴(kuò)張?jiān)谀撤N程度上被與它接觸的種皮所抑制，導(dǎo)致其形成褶皺和邊界。但機(jī)械力似乎觸發(fā)并加速了種子的成熟。然而，這種效應(yīng)的機(jī)制基礎(chǔ)仍不清楚。近日，德國(guó)萊布尼茨植物遺傳與作物植物研究所Ljudmilla Borisjuk課題組在New Phytologist上發(fā)表題為“Mechanical forces orchestrate the metabolism of the developing oilseed rape embryo”的研究論文。研究者油菜體內(nèi)體外空間限制后，進(jìn)行磁共振成像和計(jì)算機(jī)圖形重建、免疫標(biāo)記、流式細(xì)胞術(shù)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析，揭示了機(jī)械力如何調(diào)控油菜胚胎發(fā)育并啟動(dòng)其成熟過程的證據(jù)。

研究結(jié)果

1 空間限制影響胚胎發(fā)生過程

發(fā)育10天的莢果上纏繞管子阻礙種子發(fā)育的擴(kuò)張空間（圖1a，b）。研究發(fā)現(xiàn)，處理過的莢果中形成的胚胎比對(duì)照胚胎更早開始變形，并且變形進(jìn)展更快（圖1c）。處理組莢果中發(fā)育的胚胎完全占據(jù)了可用空間時(shí)，非處理組莢果種子子葉仍在擴(kuò)張。表明胚乳對(duì)空間限制的響應(yīng)比胚胎早得多（圖1e），并且胚乳在空間受限的種子中更早停止擴(kuò)張。總體結(jié)論是，減少胚胎擴(kuò)張的空間會(huì)誘導(dǎo)其過早變形。

圖1空間限制對(duì)甘藍(lán)型油菜胚胎發(fā)生的影響

2.空間限制減少了胚胎中的細(xì)胞增殖

流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定了機(jī)械壓力后15、20和25天種子胚的細(xì)胞數(shù)量。15-25的時(shí)間跨度從細(xì)胞快速增殖期結(jié)束一直延伸到細(xì)胞擴(kuò)增期。在機(jī)械壓力15天時(shí)，處理胚胎和對(duì)照胚胎的細(xì)胞數(shù)量相似(圖2a)，到20天時(shí)，處理組細(xì)胞數(shù)量增加了一倍，對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量增加了兩倍(圖2b)。這表明，限制胚胎的生長(zhǎng)會(huì)損害細(xì)胞的增殖。

圖2 空間限制條件下甘藍(lán)型油菜胚細(xì)胞增殖、基因表達(dá)及ABA含量

3.空間限制胚胎的轉(zhuǎn)錄組及代謝組分析

對(duì)機(jī)械壓力處理10和15天的處理組及對(duì)照組進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)。10天兩組樣本差異基因僅有3個(gè)，15天后增加至76個(gè)。GO富集分析顯示，機(jī)械限制導(dǎo)致處理組“細(xì)胞對(duì)缺氧的響應(yīng)”下調(diào)，而“硫酸鹽同化”上調(diào)。受壓胚胎中與壓力相關(guān)的蛋白和細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)，而與硫代葡萄糖苷合成相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。機(jī)械壓力增加了胚胎對(duì)硫的需求，這與儲(chǔ)存蛋白和硫代葡萄糖苷的合成有關(guān)。受壓胚胎中與細(xì)胞周期控制、氧化應(yīng)激防御和ABA（脫落酸）信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。通過LC-MS分析發(fā)現(xiàn)，受壓胚胎中的ABA水平更高，與此一致的是，與ABA信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)也上調(diào)。盡管施加了機(jī)械壓力，但某些已知的機(jī)械感知相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄沒有受到影響。數(shù)據(jù)表明對(duì)胚胎施加機(jī)械約束的效果是抑制細(xì)胞周期活性，同時(shí)促進(jìn)儲(chǔ)存產(chǎn)物的合成/積累、ROS防御機(jī)制和ABA相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)。

對(duì)壓力處理5、10、15、20、25和30樣本進(jìn)行靶向和非靶代謝組檢測(cè)，檢出152種代謝物。處理影響了糖酵解途徑（圖3）。處理組15/20d胚胎中，果糖-1,6-二磷酸及其兩個(gè)裂解產(chǎn)物二羥丙酮磷酸和甘油醛-3-磷酸的水平都顯著更高。處理組15d后，三酰甘油（TAG）合成前體甘油-3-磷酸（G3P）表達(dá)水平提高了九倍。機(jī)械限制15d后的胚胎進(jìn)行脂質(zhì)組檢測(cè)，鑒定出170種脂質(zhì)。壓力脅迫處理TAG含量比未受壓胚胎高17-38%。油酸（C18:1）和二十碳烯酸（C20:1）的含量增加，同時(shí)高飽和脂肪酸的比例降低?？臻g限制促進(jìn)了儲(chǔ)存脂質(zhì)的沉積開始，但對(duì)其他脂質(zhì)類別沒有影響。

圖3 空間限制條件下甘藍(lán)型油菜胚胎體內(nèi)生長(zhǎng)的代謝組變化

4.空間限制胚胎的蛋白質(zhì)組檢測(cè)

對(duì)機(jī)械限制處理10，15天的種子分別進(jìn)行蛋白質(zhì)組檢測(cè)。10d，處理組與對(duì)照組有61種蛋白存在差異；15d時(shí)，有25種差異。空間限制處理促進(jìn)了蛋白質(zhì)儲(chǔ)存沉積，特別是某些特定蛋白質(zhì)（如RmlC-like cupins、種子儲(chǔ)存白蛋白4和十字花蛋白1）的含量顯著增加。處理還影響了參與氨基酸合成、脂質(zhì)合成/儲(chǔ)存、糖類代謝、ROS代謝和糖酵解的酶的蛋白質(zhì)含量。胚胎特異性、與質(zhì)膜相關(guān)的TRAF樣家族蛋白的積累受到抑制。一些差異積累的蛋白質(zhì)也在珠被或胚乳中表達(dá)，它們的差異豐度可能與機(jī)械壓力誘導(dǎo)的珠被和/或胚乳生長(zhǎng)過早停止有關(guān)。

圖4 空間限制甘藍(lán)型油菜種子蛋白質(zhì)組的變化

5.空間限制對(duì)體外培養(yǎng)胚胎生長(zhǎng)的影響

在子葉階段切除胚胎，并在不同體積特制球形培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，來研究種子對(duì)空間限制的響應(yīng)。空間限制可以增加胚胎生物量和合成主要儲(chǔ)存產(chǎn)物的能力。生長(zhǎng)空間越小，胚胎就越小，其脂質(zhì)和蛋白質(zhì)含量就越高。在空間制條件下生長(zhǎng)的胚胎比未受阻礙生長(zhǎng)的胚胎更早且更多地積累脂質(zhì)

圖5 空間限制對(duì)甘藍(lán)型油菜胚離體培養(yǎng)生長(zhǎng)成熟的影響

6.空間限制體外培養(yǎng)胚胎轉(zhuǎn)錄組及代謝組分析

對(duì)3.5mm和5mm限制空間的培養(yǎng)室培養(yǎng)的胚胎進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，3.5mm有316個(gè)差異基因，5mm有446個(gè)。兩組差異表達(dá)的基因中有178個(gè)基因是共同的，這表明空間限制對(duì)胚胎基因表達(dá)有顯著影響。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，在機(jī)械限制下，光合作用顯著下調(diào)。與細(xì)胞增殖、細(xì)胞板形成、胚胎極性和模式建立相關(guān)的基因的下調(diào)，以及與細(xì)胞分裂和分化調(diào)節(jié)相關(guān)的基因的下調(diào)，如BAM1和SERK1。流式細(xì)胞儀測(cè)量結(jié)果表明，機(jī)械應(yīng)力的嚴(yán)重程度與胚胎細(xì)胞數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，即空間限制導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量減少。與儲(chǔ)存化合物代謝促進(jìn)相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，如編碼寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體、谷氨酸脫氫酶、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶和LEA蛋白的基因。淀粉合成的發(fā)育關(guān)閉，表現(xiàn)為顆粒結(jié)合淀粉合成酶基因表達(dá)的下降。熱休克蛋白（HSPs）基因的上調(diào)表明胚胎早熟，這是晚期種子成熟的標(biāo)志。與水分調(diào)節(jié)相關(guān)的基因，如編碼水通道活性相關(guān)蛋白的PIP3A和PIP3C，以及TPS1（海藻糖-6-磷酸合成酶）基因的表達(dá)被抑制，這與成熟種子的脫水特征一致

。空間限制處理的代謝組檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，空間限制促進(jìn)了能量豐富的核苷酸三磷酸和輔因子的積累，如維生素B6磷酸鹽、黃素單核苷酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和有機(jī)酸（三羧酸循環(huán)的中間體）?？臻g限制導(dǎo)致短鏈脂肪酸、谷胱甘肽及其前體以及某些酚酸（包括苯甲酸，作為葉酸生物合成的前體）的積累，這些物質(zhì)與多種細(xì)胞功能相關(guān)?？臻g限制的胚胎中，兩個(gè)糖酵解中間體果糖-1,6-二磷酸和二羥丙酮磷酸的水平得到提升，表明糖酵解途徑受到影響。空間限制幾乎耗盡了所有游離氨基酸（除了天冬酰胺）和多胺（如瓜氨酸）、三甲胺、乳酸和抗壞血酸，這些都是細(xì)胞代謝的關(guān)鍵成分?？臻g限制導(dǎo)致乙烯前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸的水平顯著升高。總體上，逐漸增加的機(jī)械限制在碳/氮（C/N）代謝上引起了特定變化，尤其是在核苷酸、輔因子和氧化還原代謝方面。這些發(fā)現(xiàn)表明，空間限制對(duì)胚胎的代謝途徑有顯著影響，特別是在能量代謝和儲(chǔ)存化合物的合成上。

圖6 代謝途徑圖顯示了體外培養(yǎng)的甘藍(lán)型油菜胚胎代謝產(chǎn)物豐度的變化

研究結(jié)論

本文對(duì)影響油菜胚胎體內(nèi)或體外生長(zhǎng)的機(jī)械約束的操作與分析方法相結(jié)合，包括磁共振成像和計(jì)算機(jī)圖形重建、免疫標(biāo)記、流式細(xì)胞術(shù)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析。數(shù)據(jù)表明，在體內(nèi)，施加機(jī)械約束阻礙了種皮和胚乳的擴(kuò)張，導(dǎo)致胚胎變形。胚胎發(fā)育的加速意味著細(xì)胞增殖的停止和脂肪和蛋白質(zhì)儲(chǔ)存的刺激，這是胚胎成熟的特征。潛在的分子特征包括細(xì)胞周期控制、活性氧代謝和轉(zhuǎn)錄重編程，以及糖酵解通量的變構(gòu)控制?？s小體外生長(zhǎng)的胚胎的生長(zhǎng)空間也引起了類似的反應(yīng)。結(jié)論是，對(duì)發(fā)育中的油菜胚胎的生長(zhǎng)施加機(jī)械約束是其成熟的重要觸發(fā)因素。